微卫星不稳定（MSI）检测试剂盒产品说明书 

（PCR-毛细管电泳法）

前言

  微卫星(Microsatellite)是遍布于人类基因组中的短串联重复序列。与正常组织相比，肿瘤组织的微卫星由于重复单位的插入或缺失而导致微卫星长度的改变，就叫做微卫星不稳定性(Microsatellite Instability，MSI)。研究表明，MSI是由错配修复(MMR)基因发生缺陷引起的，与肿瘤的发生密切相关。临床上已将MSI作为结直肠癌预后和制定辅助治疗方案的重要分子标志物，并应用于协助Lynch综合征筛查。

产品介绍

  本试剂盒采用多重荧光PCR的方法对检测位点进行扩增，通过毛细管电泳对扩增产物进行检测，并利用分析软件进行结果分析。其主要优点是检测准确全面、操作简单快捷、结果直观易读等。

检测位点

  Bat26、NR27、Bat25、NR24、Mono27

产品编号

  P600-S（16人份/盒）

储存条件及有效期

  1.收到干冰或冰袋冷冻运输的试剂盒后，如暂时不用，请置于-20±5℃长期保存。  

  2.有效期：-20℃保存12个月，如开启使用，尽量避免反复冻融，试剂盒反复冻融 5 次内有效，开瓶两个月内有效。 

扩增前试剂盒

扩增后试剂盒

实验所需主要仪器设备

      PCR 扩增仪、ABI 毛细管电泳仪（3500、3730 等）、96 孔板式离心机、洁净工作台、微量移液器、 冰箱等。 

试剂盒使用方法（试剂使用前请轻微振荡，并短暂离心）

1、基因组 DNA 准备

  请使用全基因组DNA提取试剂盒对待检样品进行全基因组DNA进行提取。例如：广州艾基生物技术有限公司： iPure 细胞/血液/动物组织gDNA提取试剂盒（K316-L）等试剂盒。

2、PCR 扩增

      2.1 PCR 反应 PCR 反应体系（PCR 反应液现配现用，若配制多余可-20℃保存一周，勿反复冻融。）

      2.2 PCR 程序

  备注：因各地PCR仪性能不同，循环参数中的退火温度可适当调整，调整范围±2℃内。亦可根据模板DNA量和检测信号强度来调整热循环次数。

3、毛细管电泳检测

  将PCR扩增产物3000rpm离心1分钟，取1μL PCR扩增产物与1μL LIZ-500和9 μL去离子甲酰胺（去离子甲酰胺需要自备）混合，将96孔板离心后进行毛细管电泳检测。

4、数据分析

  1. 导入panel和bin之后，使用GeneMapper对原始数据进行分析，根据微卫星不稳定评判标准对结果进行判断。(Panel,bin文件请联系公司索取。)

  2.判断标准：

   （1）高度不稳定（MSI-H）：5个分子标记中含有2个或以上出现变异。

   （2）低度不稳定（MSI-L）：5个分子标记中只有1个出现变异。

   （3）微卫星稳定（MSS）：  5个分子标记中未出现变异。

  3.峰图实例：

图1：高度不稳定（MSI-H）

图2：微卫星稳定（MSS）

样本要求

   样本类型：人 EDTA 抗凝全血。 

   样本保存：血液样本一经采集应尽快送检；或-20℃±5℃保存，24 个月内检测。基因组 DNA 一经提取应尽快检测；或 2~8℃保存，4 周内检测；或-20℃±5℃保存，24 个月内检测， 冻融不超过 5 次。 

样本DNA质量要求：DNA 应保证 OD260/OD280在 1.6~2.0 之间，浓度≥10 ng/μL。

注意事项

   1.请在使用前仔细阅读产品说明书。 

   2. 实验室应具备合理的生物安全防备设施和防护程序，实验室管理应严格按照 PCR 实验 室的管理规范，实验操作人员应具备基因扩增等相关实验操作资格。PCR 相关操作应严格 按照国家有关规定进行严格分区。实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区各阶段 用品不能交叉使用，防止核酸的交叉污染。 

   3. 实验中使用的离心管、吸头，应无菌及无核酸酶。 

   4. 实验过程中需穿戴防护衣物、一次性手套、口罩。 

   5. 检测过程中剩余的样品、PCR 扩增产物及污染的试剂和耗材等，需按相关法规条例来消 毒和处理。 

   6. 在有效期内使用试剂盒，不同批号的试剂切勿混用。 

   7. 酶混合液相关操作应在冰上进行。其他试剂使用前应完全解冻并混合均匀，尽量避免反 复冻融。 

   8.加样时，所有液体都要缓慢加至管底，不要残留在管壁上，不能用手直接触摸 PCR 管管盖。

   9.若样本存在质量问题时，如严重降解或含有 PCR 抑制剂等，检测结果可能出现杂峰或 目的扩增产物丢失，影响结果判断。

参考文献

   [1] Br J Cancer. 1998;77:2343-48.

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   [9] China Cancer. 2015;24(1):1-10.

   [10]《NCCN Guidelines colon Cancer Version 3.2017》.

   [11]《中国结直肠癌诊疗规范》2015版.