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mRNA体外转录合成

服务介绍  Service Introduction



        mRNA疫苗在COVID-19新型冠状病毒传染病的预防上起到巨大的作用而被业界所认可,mRNA therapeutics成为了一种拥有无限前景,可能颠覆现代医学技术的基因治疗平台。与重组蛋白相比,mRNA生产通过体外转录合成,更加快速灵活,低成本。在过去的十几年里,mRNA化学修饰和递送系统的重大进展快速推动该项技术应用于临床研究。mRNA 的应用前景非常广阔。 除了能够用于预防传染性疾病,mRNA 疫苗也为治疗 肿瘤、免疫疾病带来了新的星火。

        艾基生物研发了可携带100~150bp的长链 polyA的载体且可以进行体外转录的质粒, 线性化的质粒用于T7体外转录方式制备mRNA,基因长度可以长达2kb~3kb。经过加帽和磁珠纯化等一系列特定工艺流程,我们体外制备的mRNA分子可针对于不同的下游实验进行定制以及优化,如细胞转染、胚胎注射、生物药和疫苗研制等。


 

mRNA订购信息


  

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        A.   以上报价不包含体外转录载体构建费用;

        B.   mRNA合成服务,默认为mRNA分子添加5’ m7G帽子和3’ polyA尾巴;

        C.增加修饰将收取额外费用。

 

 

服务优势  Service Advantages


 

         A.   使用来源于噬菌体的T7 RNA聚合酶进行体外转录,可高效合成3 kb以上长度的mRNA分子

         B.   为mRNA分子添加5’ m7G帽子和3’100nt长度的 polyA尾巴,可以添加100个polyA以增强mRNA的稳定性和

               翻译效率

         C.免费提供不同物种的密码子优化,增强mRNA翻译效率D. 转录产物经过DNase和磷酸酶处理,去除残留DNA

               模板和mRNA 5’磷酸基团


 

 

载体图谱


 

图片1

   

合成流程以及验证


      

步骤

描述

时间

DNA 模板合成

根据客户需求设计mRNA序列,并合成对应的DNA模板。

1天

载体克隆

将目的基因的DNA模板克隆至含有T7启动子的体外转录质粒载体。

2天

载体验证

提取纯化体外转录质粒载体,进行Sanger测序和酶切验证,保证载体序列的正确性。

3天

载体线性化

体外转录之前对载体进行酶切线性化反应。

3天

体外转录反应

配置反应体系,加入线性化的体外转录载体,启动体外转录反应。

3天

纯化

使用磁珠或其他方式对转录产物进行纯化。

4天及以后

质量控制

鉴定mRNA质量,包括使用PAGE或琼脂糖胶电泳。

4天及以后

 

实验验证



        我们的体外转录mRNA经过专门优化,加强了稳定性并有助蛋白高效翻译。下图为使用我们设计的EGFP mRNA体外成功转染HEK293T细胞以及纯化后的mRNA电泳的案例:

293Ta-mRNA-0.5ug-转染48h-100x-1

图片2 

293Ta-mRNA-0.5ug-转染48h-100x-1

图片3 

图片4 

图片5 

  图片6 

图: Cap 1帽子修饰的EGFP mRNA转染HEK293T细胞。

转染后48小时进行拍摄。放大倍数:100x。左:明场。右:荧光。

图片7

 2 纯化后的Cap 1帽子修饰的EGFP mRNA的1.2%变性琼脂糖胶电泳

        泳道1:1 ug mRNA, 保存于无酶水

泳道2:1 ug mRNA,保存于1 mM柠檬酸钠缓冲液

泳道3:1.5 ug mRNA,保存于无酶水

        泳道4:1.5 ug mRNA,保存于1 mM柠檬酸钠缓冲液

L:RNA Ladder。电泳条件:200 V, 200 mA, 15 min

 

运输/储存 


        干冰运输,收到样本后-80℃保存。


 

注意事项



        1.艾基提供的mRNA保存于无酶水中并通过干冰形式运输。

        2.接收到货物后,请将mRNA放置于-80℃长期保存(可稳定保存至少6个月),或者放置于-20℃保存一周。

        3.mRNA的保质期为1年。请勿反复冻融mRNA,否则将导致其显著降解。


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