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质粒瞬转有疑问?答案全在这里了!

日期:2021-12-15

【01】做瞬转可以复苏细胞的时候直接加质粒吗?

       不可以,转染是通过物理或化学方法将外源 DNA转入细胞的过程,磷酸钙转染法和脂质体转染法为例,两种方法都需要在转染24h 前进行细胞传代,且细胞密度达到70%-80%方可进行转染实验。而细胞复苏后, 细胞未达到最佳的状态,活力为完全恢复,细胞密度未达到要求,故而不可用复苏细胞直接加质粒进行实验。

【02】细胞密度(%汇合度)会影响转染效率吗?

       是的,细胞密度会影响转染性能。细胞汇合度在 70-90%时具有优异的转染性能

【03】细胞传代次数会影响转染效率吗?

        传代次数可能会影响转染实验。传代次数过多可能会降低转染效率。我们不推荐超过20-30 次传代的细胞。如果转染性能下降并且细胞已经培养过很长时间或过度不当传代,我们建议您从液氮中复苏一管新细胞重新培养。

【04】关于转染试剂的选择,有什么推荐?

        同一种转染试剂对于不同的细胞系和细胞,其转染效果都不一样,建议您查看相关推荐后选择最适合的转染试剂。

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【05】为什么我的转染实验不具有可重复性呢?

        一般情况下,无论如何尝试控制转染影响因素,两次转染的效率仍会表现出一定程度的差异性。转染时,请保持所有转染条件基本一致,如细胞汇合度、传代次数和质粒添加量等。尽可能使用代次低的细胞。

【06】为什么我的基因在瞬时转染的表达水平要高于稳定转染?

        瞬时转染克隆的表达水平通常比较高,因为瞬时转染细胞通常具有较高的外源基因拷贝数(每个细胞几百个)。稳定转染的克隆通常有 1-2 个拷贝整合进基因组,因此其表达水平较低。有时候,稳定转染细胞的表达水平低是因为当组成型表达重组蛋白时对细胞造成了负面影响。

【07】在脂质体转染的过程中,有无必要使用无血清培养基?

        脂质体转染过程中不是必须需使用无血清培养基。但是血清会影响复合物的形成,因为蛋白质可能会干扰复合体的形成。一旦复合体形成,即可将其加入到含血清培养基的细胞中。

【08】在转染的过程中,是否可以在培养基中使用抗生素?

        不可以,抗生素,比如青霉素和链霉素,是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒,但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性,使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性,导致转染效率低。所以,在转染培养基中不能使用抗生素,甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。

【09】质粒转染前需要对质粒进行去内毒素提吗?

        需要去内毒素,因为内毒素会对细胞造成伤害,严重的甚至杀死细胞。在提取质粒的过程中,可能会残留有细菌(如大肠杆菌)产生的内毒素,内毒素水平增加可导致转染效率的大幅下降。

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【10】如何根据 A260/A280 读数来评估 DNA 的质量?

        A260 / A280 值大于或等于 1.8,意味着该质粒 DNA 是纯的;A260 / A280 读数小于 1.8,表明样品可能被芳香族产物(即苯酚)或蛋白质污染;读数大于 2.0,则表明样品被 RNA 污染。

【11】瞬转和稳转的主要区别?

        对于瞬时转染,转染的 DNA 没有整合到宿主基因组中,所以外源 DNA 在后续的细胞有丝分裂阶段将丢失。外源基因的表达是短暂的(最长 7-10 天),但表达水平很高,因为在同一个细胞里会有多个拷贝的 DNA。对于稳定转染,转染的 DNA 能够整合到宿主基因组,因此转染细胞及其子代细胞的基因组中会同时保留转染的 DNA。外源基因也会随着筛选过程而表达。由于每个细胞中只整合了 1-2 个 DNA 拷贝,所以表达水平较低。稳定转染的转染效率只有瞬时转染的 1-10%。

【12】瞬转的细胞可以传代后做功能实验吗?有效时间多久?

        一般效果在 1 周内,传不了几代就丢失了,功能性实验做不了,要想超过 1 个周最好用病毒感染细胞,获得稳转细胞系。

【13】相对于钙磷酸介导的转染,脂质体介导的转染的主要优势在哪里?

        脂质体介导的转染的主要优势是能取得更高的转染效率,即使是不能使用磷酸钙介导转染的细胞类型。此外,脂质体介导的转染不仅能用于寡聚核苷酸到大 DNA 范围内的 DNA 递送,还能递送 RNA 和蛋白质。

【14】病毒转导相对于质粒转染的优势在哪里?

        质粒转染无法用于某些细胞类型,例如非分裂细胞,而病毒转导既能用于分裂细胞又能用于非分裂细胞,比如难以转染的神经细胞。

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【15】在瞬时转染中,转染到细胞中的质粒会随着细胞的增值而复制增多吗?

        转细胞的质粒是不会复制的,真核生物没有这种机制,因此会随着细胞的生长分裂,质粒会逐渐丢失,只有整合到基因组的才会随着细胞增殖而复制。

【16】转染多久之后质粒可能会降解啊?

        瞬时转染是指将构建好的质粒通过某种方式导入到哺乳动物细胞内(主要指HEK293细胞),该质粒上的外源基因不整合到细胞自身的基因组上。随着细胞的生长分裂,外源基因会逐渐丢失。质粒在细胞内能够存在3-4天,最长7-10天就会降解

【17】检测质粒表达的蛋白,在转染后多久给药刺激质粒转录,多久后是蛋白表达的高峰呢(荧光表达达到 高峰)?

        要看细胞和质粒而定。一般情况下转染 24~48h 后。

【18】质粒瞬转后,可以传代吗?

        瞬转后尽量不要传代,否则会影响转染效率,即使传代,也最好高密度传。

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