简化基因组测序   RAD-Seq

基于酶切的简化基因组测序（Restriction-site Associated DNA Sequence, RAD-Seq）是对与限制性核酸内切酶识别位点相关的DNA进行高通量测序，可大幅降低基因组的复杂度，降低建库和测序成本，操作简便，同时不受参考基因组的限制，可快速鉴定出高密度的SNP位点，实现遗传进化分析及重要性状候选基因的预测。RAD-Seq尤其适合于大样本量的研究，可以为利用全基因组重测序技术做深度信息挖掘奠定坚实的基础。RAD-Seq技术可广泛应用于变异检测、遗传图谱构建、功能基因挖掘、群体进化等研究，具有重大的科研和产业价值。

技术路线

技术流程

技术参数

样品要求

一、变异检测：

1. DNA样品量≥ 3 ug；

2. EcoRI（GAATTC）酶切；

3. 推荐测序深度≥ 1X/个（组装样本的测序深度≥ 5X）。

二、遗传图谱：

1. DNA样品量≥ 3 ug；

2. 测序深度：亲本2-5X，子代0.8X/个（F1、F2等临时性群体），0.6X/个（RIL、DH等永久性群体）；

3. 适用范围：单倍体或者二倍体物种，所有作图群体（F1、F2；RIL、DH等），群体大小在100个以上。

三、群体进化：

1. DNA样品量≥ 3 ug；

2. 测序深度：≥ 1X/个（组装样本的测序深度5X）

3. 适用范围：单倍体或者二倍体物种中不同亚群，各亚群间划分明显，同一亚群内的个体有一定代表性，每个亚群选取10个样本左右（动物≥ 10个，植物≥ 15个），总体不少于30个样本。

四、样品细则：

1. DNA样品：请提供浓度＞100 ng/μl，总量＞3μg的DNA，OD 260/280在1.8~2.0之间，并确保DNA无降解，电泳检测无明显RNA条带，基因组条带清晰、完整，主带应在100kb以上。若样品中有多糖、糖蛋白的残留，对打断DNA样品带来非常大的困难，且很难去除，因此特别要求所提供的样品不要有多糖或糖蛋白污染。

2. 植物样品：选取植物幼嫩组织，每个样品重量＞500 mg，干冰或者液氮保存寄送。

3. 动物样品：要求新鲜动物组织，避免脂肪组织，每个样品重量＞50 mg。对于一般物种应挑选肝脏、肾脏、血液等组织取样，对于珍贵物种请提供耳样、毛发（带毛根）等脂肪含量较少的组织进行取样。为了减少个体差异对后续拼接产生的影响，尽量从同一个个体中取样。若物种体积较小，从一个个体中提取的DNA量不能满足测序实验所需，在保证量的前提下，应尽量减少采样个体的数量。提供组织样品应＞50 mg，尽量提供较多量，不同的物种DNA提取产量有差异。

4. 样品运输：送样管务必标清样品编号，管口使用Parafilm膜密封，样品请用干冰或者冰袋运输。干冰运输时间不要超过72小时；冰袋运输，时间最好不要超过24小时。样品保存期间切忌反复冻融。

常见问答

1. Q：高密度SNPs标记开发时要考虑哪些因素？

A：高密度SNPs标记开发的基本条件和设计理念是所获得的片段尽量在基因组上分布均匀，通过测定少量代表全基因组信息的序列获得成千上万个SNPs标记。首先要利用生物信息学方法对目标物种参考基因组（或已知BAC序列）进行系统分析，根据基因组GC含量、重复序列情况和基因特点等信息，选择相应的限制性酶以及测序文库类型，以保证分子标记的密度、均匀性、效率满足遗传分析和分子育种的需要。

2. Q：RAD-seq的适用范围？

A：可用于鉴定任何物种（有无参考基因组数据均可）的遗传图谱、多态（亲缘地理分析）、关联、QTL定位等分析。RAD-Seq技术可广泛应用于变异检测、遗传图谱构建、功能基因挖掘、群体进化等研究。

3. Q：用RAD-seq研究群体进化的优势是什么？

A：一般情况下，群体进化研究涉及较大的样本量，RAD-seq可大幅降低基因组的复杂度，降低建库和测序成本，操作简便。另外，它不受参考基因组的限制，研究物种范围更广泛。RAD-Seq尤其适合于大样本量的研究，可以为利用全基因组重测序技术做深度信息挖掘奠定坚实的基础。

4. Q：有参和无参的区别是什么？

A：对于发现突变信息而言，有参考基因组进行序列比对和变异检测的效率和准确率更高。而且，可以定位受选择的基因，研究群体的连锁不平衡现象。