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技术支持

致力于引进国外先进技术,为广大科研工作者和医疗机构提供高质量 的科研技术支持 。

Q:

怎样处理特殊大小的细胞?

A:

有的细胞特别大或特别小,特别是一些原代细胞,还有的细胞成团无法计数。对于这种细胞,从预实验开始就会有所不同。预实验时,保持感染时细胞的汇合率达到30~40%,即使细胞没有预定的10000 个/孔的数目,正式实验的细胞汇合率应尽量控制在这个数量。对于成团的细胞,如胰岛细胞,胚胎干细胞等,应注意细胞团的数目和大小,以便以后的实验按比例放大。


Q:

加入病毒后,目的细胞死亡很多,为什么?

A:

Lentivirus可能对您的目的细胞有一定的毒性,请调整并降低感染的MOI值,并且在感染4 h、8 h、12 h后对细胞进行换液,用新鲜的完全培养液继续培养观察。


Q:

目的细胞可以被Lentivirus感染,但是GFP荧光强度很低,为什么?

A:

目的细胞中GFP荧光强度取决于病毒感染细胞的颗粒数、细胞本身的增殖状态、细胞类型以及观察时间等。一般来讲,目的细胞感染病毒颗粒数越多,细胞本身增殖越快,GFP荧光会较强。Lentivirus属于慢病毒,一般在增殖较快的细胞中病毒感染48~72h后,GFP基因表达才达到高峰。对于增殖较慢的细胞,GFP基因表达时间还会延长。


Q:

Lentivirus对目的细胞的感染效率很低,如何提高病毒的感染效率?

A:

一般我们通过提高MOI值来提高病毒的转染效率,必要时可在培养液中加入Polybrene (4~10 µg/mL)来提高病毒的感染率。同时,目的细胞良好的生长状态是获得正常感染效率的保证。

 


Q:

全基因组de novo测序常见问题

A:

如何保证组装结果的可靠性?

对于组装的结果,除了保证Contig N50和Scaffold N50两项指标外,还需要对组装质量进行评估。如利用EST数据和RNA数据进行完整性评估,即评估组装出来的基因的完整性;利用BAC数据检验是否有装断或装错的情况,以及利用保守基因评估(CEGAM评估/BUSCO评估)基因组组装的完整性。

 

小片段和大片段的DNA样品是否需要是一样的?

(Survey和基因组 de novo 所用DNA是否需要一样的?)

原则上进行 Survey 和 de novo 使用的 DNA 是来自一个个体的。如果DNA量不足以满足整个de novo项目,则建议小片段文库的DNA必须来自同一个体,大片段文库使用同一群体的另一个个体。

 

若样品提取困难,样品量不足,有什么办法可以解决?

若老师那边样品提取困难或者样品量不足,有以下几种策略:

1. 小片段采用一个个体,大片段库采用同一群体的另一个个体;

 

2. 若一个个体的样品量不足建小片段库,可以将一个世系的样品混样进行提取;

3. 可以通过全基因组扩增技术,只需要少量的全基因组DNA,经过特殊的扩增过程,对扩增产物进行文库构建。但是全基因组扩增的缺点是对于污染部分有偏好性,若污染序列较多,扩增会增加污染的比例。

 

样品有污染对后续组装有多大的影响?

样品污染对后续组装及分析都有较大的影响,会提高组装难度,可以通过Survey分析对样品中的污染进行初步评估,在组装过程中将目标物种和污染序列分开。

 

怎样评估研究物种的基因组大小?

1. 网站查询

查询植物基因组大小的网站:http://data.kew.org/cvalues

查询动物基因组大小的网站:http://www.genomesize.com

2. 流式细胞仪方法

流式细胞仪是目前比较常用的估计基因组大小的实验方法。可以老师自己做流式评估,也可以我们帮助老师联系相关公司去做。

3. Survey评估

Survey分析,即将测序得到的reads打断成K-mer,通过K-mer分析,从数学的角度评估基因组的大小,杂合以及重复等信息。并进行初步组装,从初步组装的Contig的GC分布图上,判断该物种是否有污染等信息,从而为后续组装策略的制定提供可靠的依据。

Q:

PCR产物经克隆后测序发现,引物处的碱基有错误,怎么办?

A:

A15:因为引物纯度不可能是100%,因此,挑选克隆时,有可能挑选了杂质引物扩增出的PCR产物的克隆。此时,请重新挑选一个克隆测序,会得到正确的结果。如果挑选2 ~ 3个克隆测序情况还没改观,我们会免费重新合成引物并以最快的速度送到您的手里。如进行索赔时,按国际行业惯例,索赔范围限于制品价格范围之内。


Q:

能否根据引物电泳后EB染色后条带的亮度对合成的引物进行定量?

A:

A14:不能。因为EB是通过嵌入到核酸的双螺旋间而使其着色的。合成的DNA分子为单链,只有通过自身回折形成局部发夹环结构或链间形成部分双螺旋结构,才能被EB染色。由于不同引物的序列不同,形成双螺旋的能力不同,因此染色能力不尽相同,也就不能根据EB染色带的亮度来对合成的DNA进行定量。


Q:

合成的引物进行PCR反应时无目的条带,如何解释?

A:

PCR反应失败的原因很多,可以从以下几个方面考虑:

引物和模板是否配对,同源性有多大;

引物本身是否有立体结构;

PCR反应用试剂是否能正常工作;

PCR仪是否工作正常;

PCR反应条件是否合适;

如果一切正常,还无法解决问题时,我们可以免费重新合成引物。


Q:

使用3%Agarose凝胶电泳分析合成的引物,发现有很多条泳带?

A:

引物进行电泳一定要使用变性PAGE电泳。由于引物是单链DNA,容易形成复杂的立体结构,因此进行Agarose电泳时,容易出现多条泳带,更无法用Agarose电泳进行定量了。


Q:

测定了引物的OD值后发现A260/A280<1.8,引物纯度合格吗?

A:

由于核酸在260nm附近有强吸收,而蛋白质在280nm附近有强吸收,从生物体内提取核酸时,常用A260/A280比值来评价核酸纯度(比值在1.82.0之间),这一判断是基于序列中AGCT所占比例大致相同时的结果。而合成的DNA/RNA则不同,序列很短 (通常在2030个碱基之间),其中AGCT各种碱基所占比例很不相同,由于各种碱基的摩尔消光系数不同,因此不同碱基构成的引物的A260/A280比值也不同,例如当序列中CT碱基的含量高时,该比值会大大低于1.8。所以不能用A260/A280的比值来判断引物的纯度。


Q:

一般合成的引物末端有磷酸基团吗?

A:

没有,53末端均为-OH基。如需要加磷酸基团,则需要使用修饰合成增加磷酸化。


Q:

如何检测引物的纯度?

A:

实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的一定浓度的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,<12个碱基的引物用20%的胶,12-60个碱基的引物用16%的胶,>60个碱基的引物用12%的胶,取0.2OD左右的引物,用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和,上样前加热变性(95oC,2mins)。加入尿素的目的一是变性,二是增加样品比重,容易加样。600V电压进行电泳,一定时间后(2-3小时),剥胶,用荧光TLC板在紫外灯下检测带型,在主带之下没有杂带,说明纯度是好的(有时由于变性不充分,主带之上可能会有条带,乃是引物二级结构条带)


Q:

为何长链引物的合成费用比短链引物的要高?

A:

通常在合成长链引物时,试剂的加入量要比短链引物多很多,尤其是大于90bp以上的引物,由于成本的增加,从而导致价格也要增加。


Q:

艾基生物可以为您合成多长的序列?

A:

150碱基以下。


Q:

如何计算oligo的摩尔数?

A:

1OD值的Oligo的重量约为33 μg,而每个碱基的平均分子量一般按330道尔顿进行计算。因此, 合成oligonmol数一般按以下公式粗略地计算: nmole=(ODx33μg)/(碱基数x330)x1000=OD/碱基数x100

如果需要计算合成DNA的精确浓度,请按以下公式进行计算: nmole=(ODx1000)/[ (15.3xA#)+(7.4xC#)+(11.8xG#)+(9.3xT#) ]


Q:

oligo如何定量?

A:

用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的吸光度来定量,测定时溶液的吸光度最好稀释到0.2-0.8之间(吸光度太高或太低会有较大的误差)DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后,取部分溶液稀释到1ml并在1ml标准比色皿中测定其吸光度,即为所测体积的OD值,进而可以计算出母液的OD值。


Q:

oligo如何保存?

A:

没有溶解的引物非常稳定,可以在-20℃下保存至少1年,溶解好的引物可以事先稀释为100μmoL/L的储存液,分装数管保存于-20℃冰箱,可以保存至少半年以上(反复多次冻融会降低使用寿命)。使用前,将浓溶液稀释成工作液后进行实验。


Q:

oligo如何溶解?

A:

我们的合成报告单给出了每OD引物稀释为100μmoL/L(即100pmol/ul)浓度的加水量,您可以根椐您的实验需要加入适量的无核酸酶的双蒸水(PH>6.0)或TE缓冲液(PH 7.5-8.0),开启瓶盖溶解之前最好在3000-4000/分钟的转速下离心1分钟,防止开盖时引物散失。


Q:

艾基引物纯化方式?

A:


纯化方式

详细说明

C18 柱脱盐

又称为简易反相柱,对DNA 有特异性吸附,可被有机溶液洗脱,但不会被水洗脱,因此能有效地去除盐分。

R-PAGE

基于特异或反向层析法, 从合成好的产物中去除失败序列适于35 个碱基以下的引物。

PAGE 纯化

PAGE 纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,对引物DNA 进行分离,然后从凝胶中回收目的DNA。

HPLC 纯化

HPLC 纯化是使用高效液相色谱的原理,对引物DNA 进行纯化。该方法用于分离纯化或分析时能达到很高的纯度和灵敏度。常用的有离子交换HPLC 和反相HPLC。


Q:

引物是如何合成的?

A:

目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种,无论采用什么机器合成,合成的原理都相同,主要差别在于合成产率的高低,试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。

(1) 去保护:加入Deblocking脱去碱基上5'- OH的保护基团 DMT ,获得游离的 5'- OH;

2) 耦合:同时加入活化剂和新的碱基,新的碱基 5'- OH仍然被 DMT 保护,3' 端被活化与溶液中游离的 5'- OH发生耦合反应;

3) 封闭:耦合反应中极少数 5'- OH没有参加反应 ,用封闭试剂终止其后继续发生反应;

4) 氧化:加入氧化剂使其由核苷亚磷酸酯形成更稳定的核苷磷酸酯。

合成后处理:

切割与脱保护基:将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来。常用新鲜的浓氨水来裂解CPG与初始核苷之间的酯键。断裂下来的寡核苷酸带有自由的3’羟基。

纯化:根据所合成寡核苷酸的组成和应用来选定纯化的方法。常用的纯化方法有C18、OPC、PAGE和HPLC。

定量:根据寡核苷酸在260nm处的紫外吸收来定量。

储存:分装抽干。


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